Una mirada a: «Evolución de la expresión de Escherichia coli»

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(Este artículo pertenece al Número Especial Anticuerpos monoclonales y sus fragmentos funcionales en investigación, diagnóstico y terapia)

Abstracto

Los anticuerpos y las moléculas derivadas de anticuerpos se desarrollan continuamente como agentes terapéuticos y reactivos clave para investigaciones de diagnóstico avanzadas. De hecho, su aplicación en estos campos ha ampliado enormemente la demanda de estas moléculas y la necesidad de su producción con alto rendimiento y pureza. Si bien los anticuerpos completos requieren sistemas de expresión de mamíferos debido a la aparición de glicosilaciones importantes desde el punto de vista funcional y estructural, la mayoría de los fragmentos de anticuerpos y moléculas similares a anticuerpos no están glicosilados y se pueden preparar de manera más conveniente en plataformas de expresión basadas en E. coli. Proponemos aquí un estudio actualizado de los métodos más efectivos y apropiados de preparación de fragmentos de anticuerpos que explotan E. coli como fondo de expresión y revisamos los pros y los contras de las diferentes plataformas disponibles en la actualidad. Alrededor de 250 referencias acompañan y completan la revisión junto con algunas listas de las nuevas moléculas similares a anticuerpos más importantes que están en el mercado o se están desarrollando como nuevos agentes bioterapéuticos o de diagnóstico.

1. coli como tallo de expresión microbiana para la producción de fragmentos de anticuerpos
2. coli es una de las fábricas de células mejor establecidas para la producción de proteínas recombinantes (RPP) [43]. Actualmente, muchas herramientas y protocolos moleculares están disponibles para la producción de alto nivel de proteínas heterólogas, incluido un amplio catálogo de plásmidos de expresión y de cepas diseñadas y muchas estrategias de cultivo. Desde un punto de vista teórico, los pasos necesarios para obtener una proteína recombinante son bastante sencillos. El gen de interés (GOI) se clona en cualquier vector de expresión disponible, se transforma en el huésped de elección, se induce la expresión y la proteína está lista para la purificación y la caracterización bioquímica, estructural y funcional. Sin embargo, en la práctica, muchas cosas pueden salir mal, como un crecimiento deficiente del huésped, la formación de cuerpos de inclusión (IB), la inactividad de la proteína e incluso la falta de expresión de la proteína. Elegir la combinación perfecta no es posible a priori, por lo que se deben probar empíricamente múltiples condiciones para obtener una proteína recombinante soluble y activa.

Conclusiones

Las aplicaciones cada vez mayores de moléculas basadas en anticuerpos como agentes terapéuticos y reactivos clave para investigaciones de diagnóstico avanzadas han ampliado enormemente la demanda de estas clases cruciales de moléculas y la necesidad de su producción con alto rendimiento y pureza. Si bien la preparación de moléculas de anticuerpos completas requiere sistemas de expresión eucarióticos, los fragmentos de anticuerpos como Fabs, scFvs y otros sustitutos similares que carecen de glicosilación pueden prepararse convenientemente en fondos de E. coli. La evolución reciente de los sistemas de expresión de E. coli refuerza el uso de este microorganismo huésped fácil y económico para una producción conveniente de fragmentos de anticuerpos en forma recombinante. En la Tabla 2, presentamos una lista actualizada de los fragmentos de anticuerpos descritos hasta el momento y las condiciones de expresión utilizadas para su producción, incluida la localización de la expresión (periplasmática, citoplasmática), el tipo y formato del fragmento de anticuerpo, los vectores utilizados, el inductor, la temperatura y el tiempo de expresión, la tensión, el medio, el uso de acompañantes y la recuperación general. Como se explica en esta revisión y se reporta en la Tabla 2, durante los últimos años se han realizado grandes esfuerzos para adaptar al máximo la maquinaria de E. coli a la producción de estas moléculas “balas mágicas”, y también se ha brindado una contribución por parte de la ingeniería estructural. biología y bioinformática además de genética molecular avanzada, biología básica y biología química. El gas de progreso notable también surgió de la comprensión cada vez mayor de las características estructurales únicas de los dominios similares a Ig obtenidos mediante cristalografía de rayos X y estudios precisos de modelado de homología. De hecho, el conocimiento estructural de tales unidades básicas proporciona una contribución relevante en el diseño de construcciones para ajustar las propiedades fisicoquímicas y de afinidad y para mejorar la estabilidad, la eficacia y el potencial clínico de las moléculas similares a anticuerpos. A pesar del alto grado de similitud entre los diferentes componentes de esta clase de proteínas y la creciente disponibilidad de estrategias innovadoras y herramientas robustas, como cepas mutantes oxidantes o plásmidos para la sobreexpresión de chaperonas y foldasas, y nuevos medios de crecimiento, es evidente que no existe una metodología universal basada en E. coli para su producción eficiente, por lo tanto, es necesario un proceso de optimización de prueba y error para determinar los entornos experimentales exitosos y lograr la escalabilidad de los procesos de expresión de fragmentos de anticuerpos a nivel industrial.

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ARVYS Proteins Inc. proporciona una gama completa de servicios de proteínas a las comunidades de ciencias biológicas, farmacéuticas y biotecnológicas. Nuestra experiencia laboral abarca casi todos los aspectos de la bioquímica de proteínas, lo que nos permite contribuir a proyectos independientemente de si se encuentran en las primeras etapas de investigación o en las últimas etapas de desarrollo. Podemos ser su socio en:

– generación y expresión de proteínas recombinantes en sistemas de expresión de bacterias, baculovirus y mamíferos,

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– cultivo de células,

– purificación de proteínas recombinantes, anticuerpos o proteínas naturales,

– replegamiento de cuerpos de inclusión,

– mejora de la estabilidad de las proteínas,

– marcaje de proteínas con sondas fluorescentes, de biotina y enzimáticas,

– eliminación de endotoxinas y análisis de en vivo estudios,

– caracterización de proteínas para monitorear su integridad y funcionalidad

ARVYS Proteins Inc. es una organización de investigación por contrato (CRO) que se especializa en servicios de proteínas personalizadas para el descubrimiento de fármacos y la investigación en ciencias de la vida.